近日，Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了由扬州大学焦新安和刘巧泉课题组合作撰写的“Rice-derived SARS-CoV-2 glycoprotein S1 subunit vaccine elicits humoral and cellular immune responses”论文。该研究工作通过构建含不同启动子的载体并转化水稻，获得表达新冠病毒S1蛋白的转基因水稻。rS1蛋白可在转基因水稻种子中表达，且S1基因插入不影响水稻籽粒大小和重量。将纯化的rS1蛋白与铝佐剂联合使用，可诱导小鼠产生增强的体液免疫应答，与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白（FliC）佐剂联合使用，具有诱导体液和细胞免疫潜力。研究团队报道的这一基于水稻生物反应器表达亚单位疫苗策略，为开发安全、有效且经济的新冠疫苗提供了新路径，并且这一策略可以普遍应用于其它病毒疫苗的研发。

新冠病毒（SARS-CoV-2）自 2019 年以来在全球肆虐，尽管已有多种商业疫苗获批，但病毒持续传播与变异，疫情防控形势依旧严峻。据世界卫生组织报道，截至2024年8月，全球累计确诊超7.75亿例，死亡超700万例。开发能诱导有效免疫应答、安全且经济的疫苗，成为全球尤其是发展中国家的迫切需求。

SARS-CoV-2的S蛋白在病毒入侵宿主细胞过程中起关键作用，其S1亚基上的RBD结构域与人体ACE2受体结合，介导病毒感染，因此S1亚基成为疫苗研发的核心靶点。前期研究探索了多种疫苗策略，亚单位疫苗因安全性高而备受关注，植物作为生产疫苗抗原的平台，以其成本低、易规模化、无病原体污染及能进行真核蛋白修饰等优势，展现出巨大潜力。全文主要研究结果如下：

1.构建水稻表达系统并鉴定rS1蛋白表达

科研人员构建了两个含SARS-CoV-2 S1基因的二元载体，pCAMBIA1300Gt1-S1（水稻谷蛋白启动子Gt1）和 pCAMBIA1300Actin-S1（组成型启动子Actin）（图1a），并通过农杆菌介导转化水稻品种 ZH11，最终获得 56 株独立的T0代阳性转基因水稻植株。随后，科研人员对后代进行筛选。利用PCR分析技术，检测水稻植株中是否含有目标基因；借助潮霉素抗性分离分析，确定T3-1至T3-6植株为纯合子。利用Western blot和质谱分析技术，科研人员在pGt1::S1转基因水稻种子中检测到rS1蛋白。分子量约110 kDa的rS1蛋白条带。质谱分析确认该蛋白为rS1蛋白，检测到S1氨基酸序列的51%，且经PNGase F处理后，rS1蛋白分子量变为约76 kDa，表明发生了N-糖基化修饰（图1b-e）。与之形成对比的是，pActin::S1转基因株系未检测到rS1蛋白表达，凸显了pGt1启动子在驱动rS1蛋白表达方面的优势。

图1 水稻表达载体构建及rS1蛋白表达鉴定

2.rS1蛋白的定量与种子农艺性状

研究团队采用基于探针的qRT-PCR技术，对纯合水稻株系（T3代）中rS1蛋白的转录水平进行了测定。通过已知浓度的含S1质粒生成标准曲线，计算出 S1基因的拷贝数。在6个纯合株系中，T3-6转基因植株种子中的S1基因拷贝数最高（图2a）。利用定量Western blot分析测定rS1蛋白在纯合水稻株系中的表达水平，结果显示T3-6转基因水稻株系的表达水平最高，达到282 μg/g干重（图2b），这与qRT- PCR分析结果一致。基于这些结果，研究团队选择T3-6转基因水稻株系进行后续深入研究。为评估S1基因表达对水稻种子的影响，研究团队对T3代转基因植株（1-6号株系）的种子进行了性状考察。结果显示，转基因植株种子的粒长、粒宽和千粒重（TGW）与野生型对照相比，均无显著差异（图2c）。这一发现表明，S1基因的插入并未对水稻种子的大小和重量产生影响，为后续利用水稻生产疫苗提供了重要的可行性依据。

3.rS1蛋白的纯化与ACE2结合活性

研究人员选取表达水平最高的T3-6转基因水稻种子进行蛋白纯化。结果显示，纯化后的rS1蛋白分子量约为110 kDa，且该蛋白与兔抗RBD蛋白多克隆抗体表现出强烈且特异的反应性，表明其具有良好的免疫反应性（图2d, e）。通过ELISA分析S1蛋白与ACE2蛋白的结合活性，发现S1蛋白与ACE2的结合亲和力随ACE2 浓度的增加而增强。水稻来源的rS1（rS1 glyc）与HEK293细胞产生的S1相比，结合力较弱，但在ACE2浓度升高至100 μg/mL时，其结合亲和力接近HEK293产生的S1。此外，在较低ACE2浓度（<50 μg/mL）下，去糖基化的rS1表现出更强的结合力，而在较高浓度（>50 μg/mL）下，糖基化的rS1结合效果更佳（图2f）。糖基化与去糖基化的rS1蛋白展现出不同结合优势，为理解rS1蛋白生物学特性和疫苗优化设计提供了关键线索。

图2 rS1蛋白的定量、纯化及ACE2结合活性

4.rS1疫苗诱导体液免疫应答

为评估rS1的免疫原性，研究团队以BALB/c小鼠为实验对象，进行了免疫实验。分别肌肉注射三次rS1蛋白，同时设置了添加FliC佐剂、Alum佐剂以及不添加佐剂的组别，每次免疫间隔2周（图3a）。在第二次或第三次接种2周后，发现rS1免疫组小鼠血清中S1特异性IgG抗体滴度显著高于PBS对照组。而且，添加FliC和Alum佐剂的rS1免疫组，其IgG抗体水平显著高于未添加佐剂的rS1免疫组。第三次接种后，rS1诱导产生的S1特异性IgG滴度相较于第二次接种后提高了10倍（图3b）。此外，Alum佐剂的rS1免疫组诱导产生了更高的IgG1抗体反应，而FliC佐剂的rS1疫苗则显著提高了IgG1和IgG2a抗体反应（图3c）。为进一步探究rS1疫苗产生的抗体效果，研究人员进行SARS-CoV-2假病毒进行中和试验。结果显示，rS1 + FliC和rS1 + Alum组小鼠血清中的中和抗体（NAb）滴度显著高于rS1单独免疫组（图3d）。这表明添加佐剂的rS1疫苗能够有效中和SARS-CoV-2假病毒，为其作为疫苗的有效性提供了有力证据。

图3 rS1疫苗诱导体液免疫应答

5.rS1疫苗诱导细胞免疫应答

在第三次接种2周后，研究团队采集小鼠脾脏，通过细胞增殖和细胞因子表达分析来评估疫苗诱导的细胞免疫应答。qRT-PCR检测结果显示，与PBS组相比，rS1组小鼠体内Th1细胞因子（IFN-γ）、Th2细胞因子（IL-4和IL-10）以及Th17细胞因子（IL-17A）的mRNA表达水平显著增加。当rS1与Alum联合使用时，TNF-α、IL-4和IL-10的表达水平显著升高，而IFN-γ和IL-17A的表达无显著差异。当rS1与FliC联合使用时，IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10和IL-17A的表达均显著高于rS1单独组（图4a）。此外，通过ELISA检测脾细胞在rS1蛋白刺激两天后的细胞因子分泌水平，得到了与qRT-PCR分析一致的结果（图4b）。同时，rS1 + FliC组的脾淋巴细胞增殖水平显著高于rS1 + Alum组（图4c）。ELISpot结果显示rS1组中分泌IFN-γ和IL-4的脾淋巴细胞数量显著高于PBS组，S1 + FliC免疫组中分泌IFN-γ和IL-4的脾淋巴细胞数量显著高于rS1免疫组，表明FliC佐剂增强了rS1抗原特异的Th1/Th2混合型免疫应答。S1 + Alum免疫组中分泌IL-4的脾淋巴细胞数量显著高于rS1免疫组，而分泌IFN-γ的淋巴细胞数量与rS1免疫组相比无显著差异，表明Alum佐剂增强了抗原特异的Th2免疫应答（图 4d）。

图4 rS1疫苗诱导细胞免疫应答

6.rS1疫苗诱导细胞因子分泌的CD4+和CD8+ T细胞免疫应答

通过流式细胞术对细胞因子分泌的CD4+和CD8+ T细胞进行定量分析。与仅使用rS1免疫相比，rS1联合鞭毛蛋白FliC进行免疫接种，使得分泌IFN-γ和IL-4的CD4+ T细胞的比例更高，同时分泌IL-17A的CD4+ T细胞的表达量也有所增加。然而，在rS1 + Alum组中，只有分泌IL-4的CD4+ T细胞显著增加（图5a）。在rS1+FliC组中，观察到抗原特异性的分泌IFN-γ的CD8+ T细胞的比例显著增加。各组之间分泌IL-4的CD8+ T细胞和分泌IL-17A的CD8+ T细胞的比例没有显著差异（图5b）。

图5 rS1疫苗诱导CD4+和CD8+ T细胞免疫应答

这项研究研发的基于水稻表达系统的新冠S1亚单位疫苗策略，不仅展示了其在诱导体液免疫应答和细胞免疫应答中的有效性，也揭示了水稻作为疫苗生产平台的巨大潜力。鞭毛蛋白FliC佐剂促进了混合型Th1/Th2/Th17免疫，为优化疫苗配方、提高疫苗免疫效果提供了重要的实验依据。本研究为深入开发新冠疫苗及应对其它病毒病提供了新路径。

扬州大学宋丽讲师、硕士生温亚亚为论文共同第一作者，扬州大学焦新安教授、刘巧泉教授、潘志明教授为该研究工作共同通讯作者。研究工作得到了国家重点研发计划（2022YFC2604200）、国家自然科学基金（32102679）、江苏省重点研发计划（现代农业）（BE2021331）等项目的资助。

论文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.70077

（原文来源于植物生物技术Pbj公众号推文）